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银屑病(牛皮癣)患者皮损中细胞凋亡情况的评价

 来源:西安华西医院银屑病治疗中心 日期:2010年04月22日 浏览:

银屑病患者皮损中细胞凋亡情况的评价
银屑病(牛皮癣)患者皮损中细胞凋亡情况的评价 /zxzl.asp
中华皮肤科杂志 2000年第2期第33卷 论著
发布日期:[2005-5-30]    共阅[1768]次

作者:茅晓红 程浩 孙国均 陈智 周凯
单位:茅晓红(310009 杭州,浙江大学医学院附属第二医院皮肤科);程浩(310009 杭州,浙江大学医学院附属第二医院皮肤科);孙国均(310009 杭州,浙江大学医学院附属第二医院皮肤科);周凯(310009 杭州,浙江大学医学院附属第二医院皮肤科);陈智(浙江大学医学院传染病研究所)
关键词:银屑病;脱噬;作用Bax;抗原;CD95;Fas-L
  【摘要】目的 探讨细胞凋亡与银屑病的关系。方法 用免疫组化SP法检测银屑病皮损与非皮损中Bax、Fas、Fas-L的表达,并用TUNEL(末端脱氧核苷酰转移酶介导的d-UTP-生物素缺口末端标记)技术检测细胞凋亡情况。结果 与正常人相比,银屑病表皮角质形成细胞,真皮炎症细胞及血管内皮均存在不同程度的上述蛋白的过度表达,伴细胞凋亡增多,部分在治疗后未完全恢复正常。结论 推测银屑病皮损中角质形成细胞凋亡增多是针对细胞过度增殖的一种内在稳态机制,可能与Bax,Fas及Fas-L等凋亡相关分子的异常表达有关,而Fas系统还可能参与银屑病的局部免疫异常。
Evaluation of Cell Apoptosis in Lesional and Non- lesional Psoriatic Skin
MAO Xiaohong, CHENG Hao, SUN Guojun, et al.
  (Department of Dermatology, The 2nd Affiliated Hospital, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310009)
  【 Abstract】 Objective To study the relationship between cell apoptosis and psoriasis. Methods The expression of Bax, Fas and Fas-L was studied with immunohistochemical technique(SP), and apoptosis was detected with terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay in lesional and non-lesional psoriatic skin.Results In comparison with normal skin, there was an ove-expression of Bax, Fas and Fas-L in epidermal keratinocytes, inflammatory cells and vascular endothelium in psoriatic skin, and accompanied with up-regulation of apoptosis. The above abnormalities were not corrected completely after effective treatment in some cases. Conclusions The increase of apoptotic keratinocytes is possibly one kind of internal homeostatic mechanism against the hyperplasia of epidermal cells, and might relate to abnormal expression of apoptosis-associated proteins Bax, Fas and Fas-L. The Fas system might also take part in unusual local immunoreaction in psoriasis.
  【Key words】 Psoriasis Apoptosis Bax Antigens, CD95 Fas-L
 近年来认为细胞凋亡可能在银屑病中起作用[1]。为探讨细胞凋亡与银屑病表皮过度增殖及免疫—炎症失调之间的关系,我们对银屑病患者皮肤中Bax、Fas及其配体(Fas-L)的表达和细胞凋亡情况进行了检测。
  材料与方法
  (一)临床资料:47例银屑病患者均具典型皮损并经病理证实(以下称皮损组)及分期,且至少1个月内未经任何特殊治疗。男29例,女18例;年龄14~69岁,平均(39.21±13.80)岁;病程1个月至30年,平均6.8年。除1例红皮病型外其余均为寻常型(点滴状30例,斑块状16例),其中进行期19例,静止期25例,消退期3例;有19例同时在距皮损1cm肉眼观正常皮肤处取材(以下称非皮损组);6例经局部皮质类固醇治疗痊愈后,在原皮损处再次取材(以下称治疗后组)。对照组10例,系非皮肤病及肿瘤手术者的正常人皮肤。标本用10%甲醛溶液固定,石蜡包埋并连续切片。
  (二)免疫组化SP法:切片常规脱蜡水化,加3%H2O2室温处理10min,在枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中微波加热10min(92℃~98℃)抗原修复,冷却后加5%小牛血清处理10min,分别滴加1∶50稀释的兔抗Bax、Fas和Fas-L,4℃孵育过夜,再分别滴加1∶200稀释的羊抗兔2抗,室温30min,再加SP(1∶100)工作液室温处理30min,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封固后光镜下观察。阳性与阴性对照同时进行。所用试剂为SantaCrus公司产品。
  (三)TUNEL法:切片常规脱蜡水化,加20μg/mL蛋白酶K消化30min,0.3%H2O2处理30min,加新鲜配制的TUNEL反应液37℃湿盒孵育60min,过氧化物酶系统37℃孵育30min,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封固后光镜下观察。TUNEL试剂盒为BoehringerMannheim公司产品。
  (四)结果判断:免疫组化以胞浆或胞膜棕黄色颗粒状沉积为阳性。参照Krajewska等[2]的评分方法,先按阳性细胞比例将无、1%~25%、26%~50%、51%~75%、76%~100%分别计为0~4分;再按染色强度将无、弱、中、强分别计为0~3分,最后综合两部分得分。如某片有25%弱阳性(1×1=1)、50%中等阳性(2×2=4)及25%强阳性(1×3=3),则总分为1+4+3=8。TUNEL染色以核内棕黄色颗粒状沉积为阳性,并按阳性细胞比例计分。
  (五)统计学分析:采用SPSS/PC软件系统。显著性检验水平为0.05或0.01。
  结果
  (一)免疫组化染色:Bax、Fas、Fas-L在银屑病患者及正常人对照组中的表达见表1。其表达具有表皮上层较强,逐渐向表皮下层减弱的趋势。Bax阳性颗粒基本分布于胞浆,有时可见核周增强现象。Fas和Fas-L阳性颗粒分布于胞浆和/或胞膜,常见表皮上层网状染色。真皮炎症细胞中阳性的几乎均为单核淋巴样细胞,中性粒细胞多阴性。除炎症细胞及血管内皮外,毛囊、皮脂腺、小汗腺、汗管、肌肉、神经等亦常见阳性。
表1 Bax、Fas、Fas-L在银屑病患者及正常人皮肤中的表达
部位  总  Bax     Fas     Fas-L
    例 阳性     阳性      阳性
    数 例数 评分  例数 评分    例数  评分

皮损组
角质层 47 32 3(0~8)  38 3(0~11)** 32 2(0~9) 
颗粒层 34 34 5(2~11)*34 6(1~12)** 34 6(1~10)**
棘 层  47 47 5(2~8)* 47 5(1~10)** 46 6(0~9)**
基底层 47 47 3(1~6)  45 3(0~6)** 46 3(0~6)**
炎症细胞 47 47 3(1~7)  47 4(1~8)** 46 2(0~8)
血管内皮 47 47 3(1~7)  47 4(1~8)** 46 3(0~6)
非皮损组
角质层 19 7 0(0~7)** 3 0(0~1)   3 0(0~2)**
颗粒层 19 19 6(3~10)** 19 6(4~8)**19 6(2~11)**
棘 层 19 19 6(3~8)** 19 6(3~8)**19 6(2~10)**
基底层 19 19 3(2~6)** 19 4(2~6)**19 3(2~8)**
炎症细胞 19 18 2(0~5) 19 4(1~6)* 17 2(0~7)
血管内皮 19 18 2(0~5) 19 4(2~6)**18 3(0~5)
治疗后组
角质层 6 5 2(0~7) 1 0(0~3)   2 0(0~5)
颗粒层 6 6 5.5(2~7) 6 4.5(2~7)**6 6(2~10)*
棘 层 6 6 4.5(2~6)  6 4.5(2~7)**6 5(2~8)*
基底层 6 6  2(2~5) 6  3(1~5)**6 3(2~4)**
炎症细胞 6 6 1.5(1~8) 6  2(1~6)  6 1.5(1~3)
血管内皮 6 6 1.5(1~8) 6  4(1~6)* 6 2.5(1~4)
正常人对照组
角质层 10 10 4(3~6) 3  0(0~2)  8 2(0~4)
颗粒层 10 10 3(1~6) 3  0(0~2)  10 2(1~3)
棘 层 10 10 3(1~5) 3  0(0~2)  10 2(1~3)
基底层 10 7 2(0~3) 1  0(0~2)  5 0.5(0~3)
炎症细胞 10 9 2.5(0~5) 9  2(0~4)  8 2.5(0~5)
血管内皮 10 10 3(1~5)  10  2(1~4)   8 2.5(0~5)

  各组分别与正常人对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
  1.Bax:正常人对照组表皮、真皮少量淋巴细胞及血管内皮呈轻度阳性。皮损组颗粒层与棘层的表达高于正常人(图1)。非皮损组颗粒层、棘层、基底层的表达亦高于正常人,角质层低于正常人。治疗后组表达稍有降低,介于皮损与正常人对照组之间(差异无明显统计学意义)。另外,皮损进行期与静止期棘层的表达均高于消退期(P<0.05),静止期角质层的表达高于进行期(P<0.05)。点滴状与斑块状之间无明显差异。
 银屑病(牛皮癣)患者皮损中细胞凋亡情况的评价
             (图1)
 银屑病(牛皮癣)患者皮损中细胞凋亡情况的评价

             (图2)        
 银屑病(牛皮癣)患者皮损中细胞凋亡情况的评价

             (图3)        
 银屑病(牛皮癣)患者皮损中细胞凋亡情况的评价

             (图4)
图1 银屑病患者皮损表皮棘层角质形成细胞Bax阳性,基底层细胞多数阴性或弱阳性,炎症细胞及血管内皮弱阳性(×400)
2 银屑病患者皮损表皮角质形成细胞膜Fas阳性,表皮浅层较明显,呈网状改变(×400)
3 银屑病患者皮损表皮全层均呈Fas-L明显阳性(胞浆)。由浅层向深层逐渐减弱。真皮炎症细胞及血管内皮部分阳性(×400)图4 表皮可见大量TUNEL 染色阳性细胞(核呈棕黄色)真皮炎症细胞及血管内皮细胞部分阳性(×400)
  2.Fas:正常人对照组表皮常阴性或微弱阳性,真皮少量淋巴细胞及血管内皮呈弱阳性。而皮损(图2)与非皮损组大部分的表达均明显高于正常。治疗后组角质层及真皮层炎症细胞的表达已降至正常,其余部分虽亦有所降低,但仍高于正常。另外除炎症细胞外,皮损静止期的表达明显高于进行期(P<0.05或0.01),消退期角质层的表达低于进行期(P<0.01)及静止期(P<0.05),而基底层的表达高于进行期(P<0.05)。点滴状与斑块状之间未见明显差异。
  3.Fas-L:正常人对照组各部分呈弱阳性。皮损(图3)与非皮损组颗粒层、棘层、基底层的表达均明显高于正常,而后者角质层的表达低于正常。治疗后组颗粒层、棘层、基底层的表达虽有所降低,但仍高于正常。另外,静止期皮损各部分及消退期基底层、真皮炎症细胞及血管内皮的表达均高于进行期(P<0.05或0.01)。点滴状与斑块状之间未见明显差异。1例红皮病型患者各部位均阴性。
  (二)TUNEL:正常人对照组2例中有1例表皮仅见少量阳性细胞(0~1),真皮基本阴性。皮损组(图4)13例中有11例表皮各层见大量散在的阳性细胞(0~3),10例真皮浸润的细胞亦部分阳性(0~2)。非皮损组8例中有6例表皮各层见阳性细胞(0~3),4例真皮浸润的细胞少量阳性(0~1)。治疗后组5例中有2例表皮见少量阳性细胞(0~3),1例真皮少量阳性(0~1)。皮损、非皮损、治疗后组的阳性率依次降低。1例红皮病型各部位几乎阴性。
  讨论
  银屑病的发病被认为受多基因和细胞因子调控。Bax、Fas、Fas-L是近年来发现的具有促凋亡作用的基因编码产物。我们发现银屑病皮损中表皮各层Fas的表达均明显上调,且多数部位Fas-L明显增高,Bax轻度增高。同时TUNEL染色证实角质形成细胞凋亡增多。因此认为银屑病角质形成细胞过度增殖时亦出现Fas的过度表达,它与淋巴细胞上的Fas-L结合,并在“凋亡前蛋白”Bax的存在下激活某种杀伤机制,引起大量角质形成细胞凋亡。我们认为这种机制代偿性地削弱细胞的过度增殖,对保证银屑病角质形成细胞处于良性增生状态非常重要。但皮损中淋巴细胞Fas-L表达并无明显增高,因此这种凋亡仍未完全抵消数量更众的细胞增殖,表皮持续增厚。我们注意到静止期及消退期皮损中表皮及淋巴细胞上Fas与Fas-L表达高于进行期,提示Fas系统进一步上调可能导致角质形成细胞凋亡进一步增多,使表皮增厚趋向好转。
  我们还发现银屑病皮损与非皮损中淋巴样细胞Fas的表达明显上调,经治疗后恢复正常。已证实表达Fas-L的淋巴细胞能识别另一些Fas阳性淋巴细胞并使之凋亡,从而下调免疫反应[3];甚至某些肿瘤细胞能通过表达Fas-L并与淋巴细胞表面的Fas分子结合而诱导这些淋巴细胞凋亡[4]。因而我们认为,银屑病中当大量Fas阳性淋巴样细胞与Fas-L阳性淋巴样细胞甚至角质形成细胞相遇时,就会发生凋亡;尤其当Fas与Fas-L双阳性细胞相遇时,可互相诱导凋亡。这就使某些活化的淋巴样细胞的功能受到抑制。
  我们还推测银屑病中血管内皮过度表达Fas可吸引Fas-L阳性淋巴细胞的攻击而凋亡,有助于缓解大量的血管新生。静止期与消退期Fas系统的表达高于进行期似乎也证实了这一点。血管内皮Fas的上调在皮损出现前就已发生,治疗后未完全恢复正常,也与银屑病中血管异常最早出现,最晚消失的特点一致。至于这种上调对吸引Fas-L阳性的单核淋巴样细胞游走到局部参与免疫反应有无作用,有待进一步探讨。
  浙江省教委科研项目
  参 考 文 献
  1,Coven TR, Walters IB, Cardinale I, et al. PUVA- induced lymphocyte apoptosis: mechanism of action in psoriasis. Photodermatol Photoimmunol Photomed,1999,15:22- 27.
  2,Krajewska M, Krajewski S, Epstein JI, et al. Immunohistochemical analysis of bcl 2,bax, bcl- X, and mcl- 1 expression in prostate cancers. Am J Pathol,1996,148:1567- 1576.
  3,Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science,1995,267:1449- 1456.
  4,Hahne M, Rimoldi D,Schroter M,et al. Melanoma cell expression of Fas(Apo- 1/CD95) ligand: implications for tumor immune escape. Science, 1996,274:1363- 1366.
收稿日期:1999-02-25

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