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《斑块型银屑病表皮p16 INK4a基因启动子甲基化的初步研究》论文前言

 来源:西安兴成医院银屑病治疗中心 日期:2010年04月22日 浏览:

《斑块型银屑病表皮p16 INK4a基因启动子甲基化的初步研究》论文前言
作者:中国协和医科大学研究生院 陈敏
发布日期:[2008-10-20 12:08:00]    共阅[562]次

前言

  银屑病是一种常见的皮肤病,反复发作或迁延不愈,使患者在生理和心理上受到伤害,严重影响患者的生活质量。其发病机制包括“四大病理生理环节”:表皮过度增生,炎症细胞浸润、介质释放,局部免疫学异常,及真皮血管增生,但目前对“四大病理生理环节”之间的内在联系和造成机制尚不清楚。后基因组时代,对基因的研究己经将重点转移到影响其表达的机制上来。表遗传学是研究没有DNA序列的改变,可以遗传的调控基因表达的变化。疾病中所有与发病相关的基因都是通过其蛋白表达的异常,来实现它在疾病发生和发展过程中的功能。影响基因编码开放的因素有三方面:染色体缺失、基因突变和启动子甲基化,其中只有甲基化引起基因表达的改变是可调节的。这种可调节的特性符合银屑病自然缓解与周期性复发的特点。因此,我们推测在银屑病中,疾病相关功能基因甲基化异常,可能是银屑病发生的“触发点”和病情反复发作的“开关”。
  对DNA甲基化在银屑病发病机制中作用的研究,目前国内外还几乎处于空白,需要首先明确的基本问题主要有:(1)银屑病是否存在与其发病机制密切相关的基因甲基化异常,哪些基因甲基化异常在免疫异常和皮损形成过程中更为重要;(2)银屑病中DNA甲基化异常在基因失活机制中的地位如何,是否为导致蛋白表达和细胞效应功能异常的关键调节点;(3) DNA甲基化异常是否和细胞免疫异常有关,是直接影响Th 1 /Th2失衡,还是通过影响细胞分化、增殖、凋亡过程而造成免疫功能异常;(4)免疫异常是否通过调节疾病相关基因的甲基化状态从而引起皮损反复发作;等等。本课题组最近研究发现斑块型银屑病患者外周血单一核细胞和多形核粒细胞p16INK4a基因甲基化率较正常对照显著增高,提示甲基化异常可能在银屑病细胞免疫异常中起作用。但基因甲基化异常如何参与银屑病免疫发病机制,如何影响T淋巴细胞和角质形成细胞(KC),导致表皮异常增生,需要进一步研究来阐明。
  本课题试图以研究基因调控分子与调控机制着手,对具有代表性的p16INKa基因从基因转录水平和表达水平上进行相关性研究。以期打下基础,进而研究KC周期蛋白与结构蛋白异常与银屑病中所表现出的Thl细胞因子、促炎症因子变化之间的联系。把基因异常、细胞生物学异常、免疫分子与炎症分子异常等“四大病理生理环节”联系起来,为进一步明确疾病发生的相应关键环节及药物治疗的分子靶标奠定基础,为通过基因调控的方法控制疾病发生提供理论依据。
  涉及银屑病发病的免疫细胞主要有T淋巴细胞、抗原递呈细胞和KC。表皮KC既是靶细胞,又是免疫活性细胞。炎症和增生是银屑病发病机制的两大主题。银屑病T细胞免疫异常主要表现为Thl细胞占优势,Th 1细胞分泌的IFN- γ ,TNF-β , IL-2及和促炎症因子TNF-α与相应受体结合可刺激KC异常增殖。KC,T淋巴细胞和炎症性细胞因子相互作用形成的阳性反馈机制,促使银屑病发生和反复发作。表皮KC异常增殖和凋亡,其原因可能由表皮细胞周期调控蛋白的异常导致。p16 INK4a基因是迄今为止发现的最强的调节细胞分化、增殖的重要基因之一,其蛋白在银屑病表皮KC异常增殖和凋亡过程中起重要作用。人类p16INK4a基因位于CDKN2A基因位点,该位点包括外显子El α,Elβ和E2。研究发现p16 INK4a基因失活主要以启动子区高甲基化和缺失为主。
  因此,本课题围绕炎症和增生两大主题,以细胞周期调控相关基因p16 INK4a为切入点,研究斑块型银屑病表皮中该基因启动子甲基化的状态,以及与该基因表达的关系,进一步分析p16 INK4a基因启动子甲基化与银屑病表皮细胞免疫异常中具有代表性的细胞因子IFN- γ受体和TNF受体表达的相关性,初步探讨DNA启动子甲基化在银屑病皮损形成机制中的可能作用。
  本课题的研究着重探讨以下几个问题:1、为什么要研究银屑病表皮p16 INK4a基因启动子的甲基化状态;2、银屑病表皮p16 INK4a基因启动子甲基化是否存在异常;3、p16INK4a基因启动子甲基化与该基因的表达是否直接相关;4、p16INK4a基因启动子甲基化与银屑病表皮炎症性免疫反应是否有关;5、银屑病中除了启动子甲基化外,是否还存在其它影响p16INK4a基因表达的因素,银屑病中启动子甲基化在影响基因活性机制中的地位如何。
  检测基因甲基化的方法很多,分为单基因序列特异性甲基化分析和全基因组序列特异性甲基化分析。单基因序列特异性甲基化分析包括亚硫酸氢钠一测序法、亚硫酸氢钠一限制性酶切法、亚硫酸氢钠一MSP, COBRA, DHPLC等。文献表明基因启动子区的甲基化对转录有明显的抑制作用,而基因下游的甲基化不会抑制基因的转录。本实验的主要目的在于研究p16 INK4a基因启动子甲基化与其mRNA表达的关系,以及与IFN- γ受体和TNF受体表达的相关性。因此,本研究需要检测的是p16 INK4a基因启动子区的甲基化状态,而非外显子区。亚硫酸氢钠一MSP技术是目前最广泛采用检测启动子区甲基化的技术,该方法具有高敏感性和特异性,可检测微量DNA样品,与巢式PCR法联用检测p16INKa基因启动子区的甲基化状态,其敏感性和特异性更高。应用巢式MSP技术检测银屑病皮肤组织中DNA启动子区的甲基化状态,目前在国内外均无经验可以借鉴。由于本实验室条件和经费的限制,本研究采用RT-PCR方法先对p 16INKamRNA表达,以及IFN- γ受体和 TNF受体mRNA表达进行半定量分析,以期发现一些线索,为进一步定量分析研究打下基础。同时,本研究拟采用PCR-SSCP法检测CDK2NA基因位点外显子缺失和突变情况。实验流程图如下: 《斑块型银屑病表皮p16 INK4a基因启动子甲基化的初步研究》论文前言

 
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